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Brevetto Americano (19)                                                        (11)      N° di Brevetto:               5,733,553

Traduzione a cura di Giuliano Caimmi                        (45)      Data del Brevetto:         Mar.  31, 1998    

Dal link www.mayanmajix.com/vac_pat.pdf  (19)                                                  

 

[54]  VACCINO RICOMBINANTE PER IL CONTROLLO DELLE NASCITE

[76]  Inventore: Gursaran Prasad Talwar, dell’Istituto Nazionale di Immunologia, Shadid Jeet Singh Marg, Nuova Delhi, India;   Jay Srinivasan. Dip. Di Biologia, Campus dell’Università di Washington, Box No:1137, One Brookings Dr., St. Louis, Mo. 63130-4899; Sekhar Chakrabarti, presso gli Instituti Nazionali per la Salute, (Stanza 237, Edificio 4), Bethesda, Md. 20892

[21]  Appl. N°: 263,483

[22]  registro:  21 giugno 1994

Dati per le Varianti in territorio statuntense

[63]   Continuazione della  Serie N. 844,566,  del 27 Maggio 1992,  abbandonata.

 

[30]        Dati Prioritari per la variante per l’ Estero.

29 settembre 1989   [CA]    Canada   614520

[51]   Int CI.(6) ................................................. A61K 39/00

[52]  U.S. CI.... 424/198.1; 424/199.1;424/227.1; 435/69.1; 435/69.3

[58]  Campo di ricerca ........  424/198.1, 227.1. 424/199.1; 435/69.1, 69.3

[56]                          Referenze Citate

DOCUMENTI DEL BREVETTO STATUNITENSE

4,738,846    4/1988 Rose e sim............................... 424/87

4,780,312 10/1988 Talwar .....................................  424/88

4,847,080    7/1989 Neurath e simili......................... 424/89

DOCUMENTI DEL BREVETTO ESTERO

WO 86/07383 12/1986   WIPO(1).

ALTRE PUBBLICAZIONI

Talwar e simili, "Recenti sviluppi in immuno-contraccezione" American Journal of Obstetrics and Gynecology (1987) 157:1075-1078.

Lall e simili, "I vaccini per virus recombinanti esprimono le subunità immuno-reattive alfa dell’LH o ormone luteinizzante(2) che si associa con il PV(3) hCG per generare  un dimero bioattivo(4)" Quaderni indiani di Biochimica e Biofisica (1988) 25:510-514. Edwards, Rg. Conception in the Human Female, pp. 200-201, 1980, Academic Press.

Niles, E.D., e simili,  "Il gene D8 del virus vaccinale genera una proteina transmembranica detta virione o particella virale(5) " J. Viol. (1988) 62(10):3772-3778. Chakrabarti, S., e simili, "Espressione of gonadotropina corionica umana biologicamente attiva e le sue subunità ricom­binanti con il virus del vaccino" Gene (1989) 77:89-93. Smith, G.L., et al., "Ricombinanze del virus del vaccino da infezione che esprimono l’antigene superficiale del virus B dell’epatite' Watere (1983) 302:490-495.

Primario Esaminante—Lila Feisee

Assistente Esaminante—Julie E. Reeves

(57) Procuratore, Agente, o Firma legale—Morrison & Foerster

Riassunto

Un vaccino per il controllo della nascita composto da una beta subunità di umana gonadotropina corionica (HCG)(6), un ormone ricombinante luteiniz­zante o a mescolanza di questo. Questo vaccino ricombinante per il controllo delle nascite può anche agire come vaccino contro una proteina o un peptide non associato con il sistema riproduttivo mammifero, come ad esempio una proteina o peptide associato ad un organismo patogeno come quello dell’epatite B.

8 Richieste, 12 Fogli

 

 

 


 

note:

(1) WIPO - World Intellectual Property Organization, Organizzazione per la proprietà intellettuale dei brevetti a livello mondiale.

(2) L'LH e l'FSH sono due ormoni prodotti dall'ipofisi che insieme provvedono alla stimolazione delle gonadi (ghiandole sessuali).

(3) PV = Bleeding per vaginum, il sanguinamento vaginale in gravidanza.

(4) Un dimero è una molecola formata dall'unione di due subunità (dette monomeri) di identica natura chimica (omodimero) oppure di natura chimica differente (eterodimero). Per dar vita ad un dimero, i monomeri devono essere uniti tramite un legame chimico forte (di solito covalente)

(5) Virione: una particella virale completa di DNA o RNA e rivestimento proteinico come è fuori di una cellula.

(6) La gonadotropina corionica umana (hCG) è un ormone reso dalle cellule corioniche nella parte fetale della placenta. L’hCG è diretto alle gonadi e le stimola, da cui il nome "gonadotropina". La presenza di hCG si può determinare grazie a strumenti immunologici, in giorni di fertilizzazione e forma il fondamento dei più comuni testi di gravidanza. Il livello di hCG tende ad essere più alto con il feto femminile poco dopo il concepimento.

 


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Traduzione a cura di Giuliano Caimmi       pag 2 di 12        (45)      Data del Brevetto:         Mar.  31, 1998    



FIG. 1

STRATEGIA PER LA COSTRUZIONE DI UN phCG ANCORATO

immagine fig01


Separazione della digestione del Xhol(7) con Eluizione(8) in gel di agarosa(9) di un frammento di xhol di 1"6 kb

Digest with Alu I (10)

Elettroforesi in un 5% di gel Acrilamide

Eluizione del frammento Alu I-Xhol

                                                                          Blunt ending with Klenow dNTPs

p11 . P7.5

immagine fig02

Ligasi smussata (blunt end)(11)

 

Digestione con l’enzima SMA1(12) per rimuovere i dati di fondo e trasformare le cellule DH 1(13) dell’ E. Coli (14)

 

 


note:

(7) Bibliografia utile: http://www.springer.com/life+sciences/cell+biology/book/978-1-58829-436-4?cm_mmc=Google-_-Book%20Search-_-Springer-_-0

 

http://www.deastore.com/libro/usr/9788847001213.html

http://www.springer.com/astronomy/book/978-88-470-1967-6?changeHeader

(8) L'eluizione (o eluzione), nella chimica analitica o inorganica, è la separazione di due o più sostanze assorbite in una colonna cromatografica per lavaggio con un opportuno solvente.

(9) Vedi l’ Elettroforesi. L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa; nel primo caso il processo è detto cataforesi, nel secondo anaforesi.

(10) Alu I è un enzima dal nome Arthrobacter Luteus.

(11) La ligation in chimica corrisponde al DNA ligasi, è un enzima appartenente alla categoria delle ligasi che, in ingegneria genetica, viene utilizzato per "incollare" un tratto specifico di DNA, contenente il gene da studiare, in un plasmide batterico o in un altro vettore.

(12) Si veda una trattazione esauriente a cura di Vittorio Scornaienchi, del Dip. Di Biologia Cellulare dell’ Unversità di Calabria, ad Arcavacata di Rende (CS) http://biologia.unical.it/openlab/documenti/pdf/enzimi%20di%20restrizione.pdf

(13) Uno dei gruppi di cellule staminali dell E.Coli.

(14) Escherichia coli, abbreviato E. coli, è la specie più nota del genere dei batteri Escherichia fra 171 sierotipi caratterizzati da diverse combinazioni degli antigeni O, H, K, F. Questi batteri vivono nella parte inferiore dell'intestino di animali a sangue caldo (uccelli e mammiferi, incluso l'uomo), detti per questo enterobatteri – l’ E. Coli è il batterio modello fra questi - e sono necessari per la digestione corretta del cibo. La sua presenza nei corpi idrici segnala la presenza di condizioni di fecalizzazione (è il principale indicatore di contaminazione fecale, insieme agli enterococchi). Il nome deriva dal suo scopritore, il tedesco-austriaco Theodor Escherich.

 


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Traduzione a cura di Giuliano Caimmi       pag 3 di 12        (45)      Data del Brevetto:         Mar.  31, 1998    

 


 

Determinare l’ orientamento tramite le digestioni ristrette

                                            E purificare il clone riportando il gene nel giusto orientamento

                                                    La transfezione(15) di cellule mammifere infettate

Selezione del virus ricombinante



note:

(15) Per trasfezione si intende il processo di introduzione di materiale biologico esogeno in cellule eucariotiche e nella gran parte dei casi di mammifero. È più frequente l'inserimento di materiale genetico, tra cui solitamente DNA e siRNA, ma, in generale, possono essere trasfettate anche proteine (come ad esempio anticorpi). Il processo e i metodi per attuarlo sono analoghi a quelli per la trasformazione batterica, che però riguarda batteri e, talvolta, le cellule vegetali.

 


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Traduzione a cura di Giuliano Caimmi       pag 4 di 12        (45)      Data del Brevetto:         Mar.  31, 1998   

 


 

FIG.2

 immagine fig03

 



EcoRI

 

 immagine fig04

Digestione dell’enzima BglII.

Polimerasi dell’ enzima Klenow.(16)

α oLH

clip image001
EcoRI 8 - mer

ligasi di Linker(17)e (18)

clip image002 

EcoR

 ↓

←EcoRI digestion←

clip image003

 

 

 


note:

(16)Nei primi studi riguardanti la PCR veniva usata un frammento di DNA polimerasi di E Coli, detto frammento di Klenow, ottenuto tramite digestione enzimatica. Le temperature necessarie per la denaturazione del DNA, sfortunatamente, disattivavano quest'enzima che doveva, così, essere reinserito nella provetta dopo ogni fase di denaturazione. La successiva introduzione della Taq polimerasi, termostabile, permise di risolvere quest'inconveniente piuttosto noioso.
La Taq polimerasi ha consentito di ottenere anche un miglioramento nella specificità della PCR in quanto ha permesso l'uso di temperature di ricottura e di allungamento più elevate rispetto a quelle possibili con il frammento di Klenow, il che rende la reazione più stringente.

 

(17) A proposito del MER, Moment Estimate of Relatedness, vale a dire le relazioni genetiche all’interno e fra popolazioni, si veda il link, in inglese:

http://www.zsl.org/science/research/software/mer,1152,AR.html

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1462003/pdf/11901134.pdf

(18) Il Linker DNA, è quella parte della mappa del genoma che unisce due nucleo somi. Il linker della cellula B è un gene umano che codifica un linker proteinico riferito alle cellule B o linfociti B, cellule del sistema immunitario che giocano un ruolo primario nell'Immunità umorale e dell'Immunità acquisita (al contrario dei linfociti T che sono fondamentali nella Immunità cellulare). La principale funzione dei linfociti B è quella di stimolare la produzione di anticorpi contro uno specifico antigene svolgendo il ruolo di Cellula APC (cellula presentante l'antigene).

 

 


FIG. 3

Dose=108 pfu

clip image004

 

SETTIMANE DOPO L’IMMUNIZZAZIONE


 


Capacità Neutralizzante dell’hCG ( ng/ml )

Capacità binding(19) dell’hCG (ng/ mi )

Fig. 4a

clip image f4a


Fig. 4b

clip image f4b

(19)  Si veda, sulla ‘binding capacity’: http://www.millipore.com/publications.nsf/a73664f9f981af8c852569b9005b4eee/d7d2085b89771d2b85256fe80051b050/$FILE/TB1175EN00.pdf

 


 


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U.S. Patent Mar.                                                       31, 1998 Sheet 6 of 12                                                  5,733,553

 

 


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Fig. 5

STRATEGIA PER LA COSTRUZIONE DI UN βhCG-HBsAg (Pre S2 + S)

clip image fig5

(20) Per trasfezione si intende il processo deliberato di introduzione di materiale biologico esogeno in cellule eucaristiche (dal greco Eu 'perfetto' e Karyon 'nucleo’, lett. e tassonomicamente, il livello più alto della classificazione scientifica, in cui si dividono gli esseri viventi) e nella gran parte dei casi di mammifero. È più frequente l'inserimento di materiale genetico, tra cui solitamente DNA e RNA, ma, in generale, possono essere transfettate anche proteine (come ad esempio anticorpi). Il processo e i metodi per attuarlo sono analoghi a quelli per la trasformazione batterica, che però riguarda batteri e, talvolta, le cellule vegetali.

 

 


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Traduzione a cura di Giuliano Caimmi       pag 11 di 12      (45)      Data del Brevetto:         Mar.  31, 1998

 


 

SUB CLONAZIONE DI REGIONI GENOMICHE HBV (EPATITE VIRALE B) IN pUC(21)

EcoRI

clip image ecori

clip image doppia dig

 

 


 (21)Nella biotecnologia alimentare, sezione della biotecnologia e genetica pUC è un’espressione largamente usata per indicare un plasmide che contiene il gene β-galattosidasi, un enzima idrolitico che catalizza l'idrolisi dei residui terminali di β-D-galattosio nei polisaccaridi noti come beta-galattosidi, tramite la rottura dei legami beta-glicosidici terminali. Siamo nel campo della genomica molecolare e della clonazione del DNA, la mappa genetica umana. La genomica è una branca della biologia molecolare che si occupa dello studio del genoma degli organismi viventi. In particolare si occupa della struttura, contenuto, funzione ed evoluzione del genoma. È una scienza che si basa sulla bioinformatica per l'elaborazione e la visualizzazione dell'enorme quantità di dati che produce. Per un glossario in inglese si veda http://www.expertglossary.com/biotech-genetics/definition/puc. Per un’introduzione alla clonazione è completo il documento all'indirizzo http://www.cusmibio.unimi.it/scaricare/biancoblu.pdf

 


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Traduzione a cura di Giuliano Caimmi       pag 12 di 12      (45)      Data del Brevetto:         Mar.  31, 1998

 


 

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Traduzione a cura di Giuliano Caimmi  Par 13, pag 12 di 12      (45)      Data del Brevetto:         Mar.  31, 1998

 


 

FIG. 9

VSS4:10°

pfu/animale

             indice di positività 7/7    

clip image fig9


 


 

 

1

VACCINO RICOMBINANTE(22) PER IL CONTROLLO DELLE NASCITE

Questa scheda è la continuazione della serie N°. 07/844,566, datata 27 maggio 1992, ora abbandonata.

La popolazione mondiale sta crescendo a velocità elevata in molti paesi economicamente sviluppati e c’è il continuo bisogno di un metodo alternativo per regolare la fertilità. Noi avevamo proposto, diversi anni or sono, un vaccino per il controllo delle nascite che presenta la formazione di anticorpi contro l’ormone della gravidanza, la gonadotropina corionica umana o hCG. Queste invenzioni sono descritte nei brevetti depositati in India, Stati Uniti e diversi altri paesi del mondo. (Ref. EP 204566, JP 62286928, CA 1239346, U.S. Pat. No. 4,780312, CN 8603854). Ora descriveremo un’altra invenzione che genera una risposta di anticorpi di lunga durata contro l’hCG, dopo una o un numero limitato di iniezioni.

Pertanto la possibilità d controllare la fertilità scagliando anticorpi contro l’ormone della gravidanza è ben nota dai nostri precedenti studi e quelli di altri, i vaccini utilizzati prima erano complementari di due o più peptidi, come quello naturale dell’ hCG di 145 amminoacidi collegato al tetano toxoide o simili portatori. In un altro modo, il peptide βhCG era associato all’alfa oLH e poi connesso ai portatori  (Talwar e simili del 1988; brevetto USA n. 4,780,312). Questi vaccini richiedono purificazione e preparazione delle proteine esistenti dalle loro fonti naturali. Il costo di alcune di esse al momento è molto elevato il che risulta molto restrittivo per l’utilizzo in larga scala per programmi di pianificazione familiare nei paesi economicamente sviluppati. Inoltre, questi vaccini richiedono tre iniezioni per una iniziale immunizzazione seguite da una quarta di richiamo. Un vantaggio maggiore di tale prospetto è la possibilità di ottenere una risposta in anticorpi soddisfacente e sostenuta con una prima iniezione e al massimo un richiamo soltanto. Un altro aspetto interessante è il basso costo con cui questo vaccino può essere preparato e reso disponibile sul mercato in larga scala.

Il virus dei vaccini è ben noto per essere uno strumento dei biologi molecolari. Nella rivista New Scientist del 3 dicembre del 1988, a p. 38, si trova un articolo che fa riferimento ad un nuovo vaccino per il virus della peste bovina (rinderpest)(23) nel bestiame e afferma che il vaccino sia geneticamente una versione ingegnerizzata del virus del vaccino, avendo due ricercatori trasformato due geni prelevati dai tessuti di un virus bovino nel virus vaccinale.

In un articolo di Tibtech datato gennaio 1990, Miner e simili (pp. 20-25), si discute il virus del vaccino come uno strumento versatile per gli studiosi di biologia molecolare e si suggerisce che il “sistema del virus del vaccino è una promettente via per produrre significative quantità di proteine eucariote(24) nelle cellule mammifere, correttamente processate e modificate”.

2

Il brevetto statunitense n° 4.603.112 (inventori: E. Paoletti(25) e simili, depositato il 29 luglio 1986) rivela metodi per modificare il genoma del virus del vaccino per produrre virus vaccinali ricombinanti con DNA incluso non presenti in natura. Mentre tale riferimento tiene conto della codifica DNA “eterologo” in una proteina che possa fungere da antigene, non sembra essere di alcuna suggestività il fatto che questa tecnologia sia la strada per i vaccini per il controllo delle nascite o semplicemente vaccini che per il controllo delle nascite che si duplicano come vaccini in grado di scagliare anticorpi contro proteine o peptidi non associati al sistema riproduttivo mammifero.

La pubblicazione della Patent Cooperation Treaty (PCT) n° WO88/06626 (inventore: B.R. Bloom e simili; registrato il 29 febbraio 1988 (26) fa riferimento all’uso di micro batteri ricombinanti come veicoli in grado di esprimere un DNA forestiero. Dice anche che tali micro batteri potrebbero essere usati come veicolo per un vaccino anti fertilità. Tuttavia, sembra non fare alcun cenno all’uso dei batteri per il controllo della fertilità e inoltre dissuade i lettori dall’uso di vaccini in questo campo sottolineando tutti gli svantaggi uno ad uno alle pagine 4 e 5.

5. Dunque sembra essere una necessità provvedere ad un vaccino sicuro, semplice ma efficace per il controllo delle nascite, che abbia un costo basso e che possa anche, su richiesta, agire da vaccino contro i disordini associati al sistema non riproduttivo come le infezioni da batteri e virus.

Mentre alcune delle fonti suggeriscono l’uso di vaccini come strumento tecnologico, altre 10 fonti, in particolare Bloom e simili, sembrano dissuadere fortemente dal considerarli. Date le spese sostenute in questo tipo di ricerche non si può certamente affermare che vi siano segnali inequivocabili di lavori di ricerca che mirino all’uso di vaccini per il controllo delle nascite.

15 L’attuale invenzione pertanto fornisce una sequenza nucleotide che comprende una prima sequenza che codifica un ormone peptide per la riproduttività mammifera oppure un frammento di esso in allineamento di lettura di fotogrammi 20 con un gene o un frammento di gene che codifica una proteina o peptide non associato a un sistema riproduttivo mammifero e una seconda sequenza che codifica almeno parte di un genoma per il virus del vaccino.

25 L’invenzione fornisce anche una sequenza nucleotide comprendente una prima sequenza che codifica una sub unità beta di una gonadotropina corionica, un’alfa sub unità di un ormone luteinizzante o anche una sub unità beta di gonadotropina corionica o una sub unità di ormone luteinizzante in allineamento a lettura fotogrammica con un gene o un frammento di gene che codifica 30 una proteina o un peptide non associato con un sistema riproduttivo mammifero e una seconda sequenza che codifica almeno una parte di un genoma del virus del vaccino.unità

35 L’ invenzione fornisce anche una sequenza di nucleotide che comprende una prima sequenza che codifica una beta di gonadotropina corionica umana, un’alfa sub unità di ormone luteinizzante ovina o anche una beta sub unità di gonadotropina corionica ovina o una sub unità alfa di un ormone ovino lutein­izzante in allineamento con una lettura a fotogrammi con un gene o un frammento di gene che codifica la proteina superficiale dell’epatite B, e 40 una seconda sequenza che codifica almeno una parte di un genoma del virus del vaccino.

Le sequenze nucleotidi summenzionate sono preferibilmente inserite in una parte non essenziale del genoma del virus del vaccino per rendere un virus di vaccino ricombinante.

45 Il vaccino può consistere in geni della sub unità beta di hCG fusa a livello di DNA con un frammento di gene che codifica una proteina o peptide transmembranale. Un peptide transmembranale selezionato comprende 49 amminoacidi. Un vaccino analogo può consistere in una miscela fisica di vaccino-βhCG (vale a dire vSS2) e un ormone luteinizzante ovino per vaccino alfa oLH, vale a dire 50vSL5.

Secondo la presente invenzione si fornisce un vaccino per il controllo delle nascite che comprende una sub unità beta ricombinante di gonadotropina corionica umana, un 55 ormone luteinizzante ovino ricombinante alfa o una miscela di entrambi.

Un selezionato incapsulamento comprende un virus ricombinante, il vSS2, in cui il gene per la beta sub unità di hCG fusa con il gene che codifica il peptide transmembranale è inserita nel virus vaccinale.

60 Un ulteriore incapsulamento comprende un virus ricombinante, il vSS2, in cui il gene per la beta sub unità di hCG fusa con il gene che codifica un peptide transmembranale è inserito nel virus del vaccino.

 


note:

(22) In campo biotecnologico, ricombinanti sono una serie di procedure usate per ‘unire’ (ricombinare) segmenti di DNA fra loro. Un DNA ricombinante è costruito (ricombinato) da segmenti di 2 o più molecole di DNA diverse. In talune circostanze una molecola di DNA ricombinante può entrare in una cellula e lì replicarsi, per conto suo, del tutto autonomamente o tutt'al più dopo essersi integrata in un cromosoma. Fonte: http://www.medterms.com/script/main/art.asp?articlekey=3102

(24) Eucariota (in inglese eucharyotic) è quel termine che definisce il compartimento più importante, il nucleo di questa cellula, un organulo in cui viene conservato il DNA cellulare e che dà il nome alla cellula stessa (dal greco ευ κάρυον, ‘nucleo buono’)

(25) Parliamo del prof. Sergio Paoletti, attuale pro rettore vicario dell’Università di Trieste, Cv al link http://www.units.it/data/curricula/2356.pdf e tuttora autore di brevetti in campo biotecnologico: http://www2.units.it/imprese/files/21_Paoletti.pdf .

(26)  Per cercare un brevetto è possibile avvalersi del sito http://www.patentstorm.us/ .

 


Un ulteriore incapsulamento comprende un virus ricombinante, il vSL5, in cui il gene per la beta sub unità di hCG fusa con il gene per l’alfa subuntà d oLH è inserita nel virus del vaccino.

Un ulteriore incapsulamento comprende 65 un virus ricombinante in cui una prima sequenza di nucleotidi comprende l’unità βhCG in allineamento di lettura fotogrammica che codifica la proteina mediana della proteina superficiale dell’epatite B.

3

Altre proteine di altri organismi, specialmente se patogeni, o persino sequenze sintetiche possono essere codificate in luogo delle proteine dell’epatite B.

DESCRIZIONE BREVE DEI DISEGNI

Nei disegni che illustrano le invenzioni.

FIG. 1 mostra la strategia per la costruzione dell’hCG beta ancorato;

FIG. 2 mostra la strategia per l’inserimento del gene alfa oLH nel virus del vaccino;

FIG. 3 dimostra la risposta anti hCG intermini di capacità di legatura. La figura mostra una risposta tipica dell’anticorpo in 4 topi a cui è stato somministrato un’inoculazione di vaccino ricombinante vSS2 in una dose di 10 pfu. Ciascuna delle risposte in anticorpi delle cavie animali si possono misurare in circa 4 settimane. Gli indicatori che vanno da 100 a 900 ng/ml sono distintamente al di sopra della soglia dei 20 ng/ml considerata come protettiva contro la gravidanza. Tali indicatori sono stati mantenuti per oltre 12 settimane sotto osservazione.

FIGG.Da 4a a Ah mostrano la formazione degli anticorpi hCG in otto macachi dal berretto indiano a c sviluppo di hCi è stato iniettato il vaccino ricombinante con il vSS2.

FIG. 5 mostra la strategia per la costruzione del βhCG-HBsAg. Si evidenzia il plasmide finale, pSS4 assieme alle sequenze giunte fra  il BhCG e l’ HBsAg.

FIG. 6 mostra una macchietta a sud del pSS4. Il gene S tradotto con un soprannome era usato come specillo e lavato ad alta severità.

FIG. 7 mostra la sub clonazione della mappa genetica dell’epatite B nei plasmidi pUC.

FIG. 8 da risultati campione per il βhCG e l’ BsAg. Sull’asse X ci sono due ricombinanti paralleli purificati del virus vSS4 (1,2 and 3) insieme al vSS2, un controllo interno e dei controlli negativi e positivi di tipo Abbott.

FIG. 9 mostra lo sviluppo di anticorpi hCG in 7 ratti a cui sia stato iniettato il vaccino ricombinante con vSS4.

 


ESEMPIO 1

Sintesi e Utilità del Vaccino Anti-hCG Ricombinante.

La strategia di costruzione del vSS2: il virus contenente il βhCG ancorato è stato ricavato da una fusione in frame dei domini transmembranali e citoplasmici del gene che codifica la glucoproteina (VSVg) del virus vescicolare della stomatite alla estremità 3 del βhCG cDNA (FIG.1). Il gene VSVg (Vesicular stomatitis Indiana Virus Gene) è stato digerito con Alu I e Xho I per realizzare la sequenza di una membrana di 249 dp. Questo frammento è stato eluito da un gel di acrilamide, riempito con il sistema Klenow e ligato al vettore pSSI dell’ SMA I, quest’ultimo preparato con la procedura descritta da noi in precedenza (Chakrabartit e simili del 1989).

L’orientamento della sequenza di ancoraggio al βhCG è stata ispezionata attraverso le digestioni dell’enzima adatto per la restrizione. Questo è stato usato per trasferire le cellule CV-1 preinfettate con con il virus di tipo selvaggio e i ricombinanti sono stati prelevati tramite uno screening visivo delle placche blu grazie ad una tecnica altrove descritta.

Saggio del βhCG.

L’espressione del βhCG è stata rilevata nella pallina delle cellule vSS2 infettate da un campione immunoradiologico competitivo che usa anticorpi monocloni sollevati contro il βhCG. La localizzazione cellulare del βhCG è stata determinata tramite la tecnica della immunofluorescenza che usa anti βhCG

MoAb seguiti da conigli anti-ratto coniugato all’apparato in fibra ottica FTTC(27).

Proprietà immunologiche

Una singola iniezione sottocutanea di 108 unità di vSS2 provoca la formazione di anticorpi nei ratti che hanno reagito con il βhCG (FIG. 3) e ha prevenuto in effetti la legatura del βhCG ai recettori su un tessuto campione. In 4 settimane si sono potuti rilevare gli anticorpi. Gli indicatori sono stati mantenuti senza decadimenti per un periodo di diverse settimane.

4

Gli indicatori degli anticorpi nelle scimmie immunizzate con il vaccino anti βhCG vSS2: i macachi radiati sono stati immunizzati con 108 unità di vaccino ricombinante.

5

Due iniezioni immunizzanti sono state praticate ad un intervallo di 3 mesi una dall’ altra (da 0 al 95° giorno). Quattro mesi dopo (giorno 226°) un’iniezione di richiamo di 100 microgrammi di βhCG assorbito su allume di potassio per via intramuscolare. Gli anticorpi βhCG sono stati misurati tramite dosaggio radioimmunologico (RIA dall'inglese Radio Immuno Assay) (Cfr. Om Singh e simili).

10

Questi sono espressi sull’ordinata di una scala logaritmica. Gli indicatori degli anticorpi sono stati misurati dopo la prima immunizzazione con il vaccino ricombinante. Tali indicatori dopo una prima iniezione e un richiamo sono aumentati a livelli molto alti che vanno da 3.200 a 14.000 nanogrammi di capacità di legatura del βhCG per mi.

15

Questi anticorpi avevano un’affinità alta (ka= 10~ULM). Gli anticorpi avevano il compito di prevenire la legatura del βhCG ai recettori del tessuto come determinato dai campioni radio di recettori competitivi. (H       H).

20

Il ruolo degli anticorpi di neutralizzazione della efficacia biologica del βhCG indica l’efficacia dell’immunizzazione con questi vaccini che hanno lo scopo di intercettare eventi a carico dell’ormone βhCG, come l’impianto e il mantenimento della prima gravidanza.  

25

La FIG. 4 rende i dati in 8 macachi per dimostrare la consistenza del fenomeno. Questi esperimenti dimostrano anche la immunogenicità di questi prodotti non solo nei roditori ma anche nei primati (e, per estensione, gli umani).

Finora, i migliori risultati sia nei macachi che nei ratti si sono ottenuti con 108 unità. Uno spettro operativo va da 109 unità fino a 104, meglio se da 107 a 108.

30

Un dato interessante, la dose non sembra funzionare in questo caso su una base di un peso corporeo e questo può essere connesso all’uso di un vaccino vivo. Una certa attenuazione nei passaggi può risultare utile ad evitare possibili effetti collaterali.

35

 ESEMPIO 2

Sintesi e Utilità del vaccino anti oLH

Costruzione del vSL5: l’ αoLH cDNA è stato tagliato da un enzima della restrizione Bgl II da un vettore sopradescritto (Lall e sim., 1988). Questo frammento è stato riempito con Klenow, ligato a 8 linkers ad 8 mer Eco RI e clonato in un unico sito Eco RI del vettore del vaccino pSC45 (FIG. 2).

40

Il plasmide finale, pSL5, è stato caratterizzato in dettaglio basandosi sull’orientamento corretto del gene oLH tramite le digestioni multiple dell’enzima della restrizione e l’ibridazione con la tecnica del Southern Blot(28).

45     

 


 note:

  1. http://it.wikipedia.org/wiki/Fttx

  2. http://it.wikipedia.org/wiki/Southern_blot


 

Questo plasmide è stato in seguito usato nella transfezione per costruire il virus ricombinante vSL5 come descritto prima.

Saggio di αoLH.

E’ stato preso un campione dalla parte di mezzo delle cellule infettate con il virus ricombinante vSL5, è stato testata la presenza di αoLH tramite dosaggio radioimmunologico usando gli anticorpi αoLH ottenuti dalle scimmie.

50

E’ stata misurata con precisione l’espressione del αoLH usando una sub unità standard di peptide. Si potrebbe rilevare la presenza di αoLH in 3 ore dall’infezione e si vedrà che è attorno a 280 nanogrammi/milligrammo/3x106 di cellule in 24 ore.

55

ESEMPIO 3

Produzione di Vaccini Ricombinanti Misti

Attività biologica: la sub unità di αoLH si associa con il βhCG per formare un etero dimero.

60

La capacità di questo etero dimero di stimolare la steroidogènei(29) in un sistema di cellule tumorali di Leydig è ormai acquisita (Talwar et al., 1988). Per dimostrare che il ricombinante l’eterodimero ricombinante αoLH- βhCG conserva la sua attività biologica, è stata effettuata una infezione di virus vSSl e vSL5 nelle cellule CV1

65

La post infezione ottenuta in 24 ore supernatante è stata usata in un campione biologico di cellule tumorali di Leydig. La steroidogenesi così ottenuta dall’esplicito etero dimero αoLH- βhCG è stata maggiore del dimero hCG che indica la corretta espressione a lunghezza piena dei due peptidi.

5

Una risposta immunologica simile e in un certo senso anche più efficace sotto il profilo biologico a quanto mostrato dalla costruzione della sola vSS2 potrebbe generarsi usando una miscela delle due vSS, la 2 e la 5 così ricavate. E’ noto da altri studi che gli anticorpi generati da un dimero αoLH- βhCG di specie diverse di hanno un’efficacia biologica maggiore del 25 per cento come funzione dei loro parametri immunologici se messa a confronto con quelli generati per il solo βhCG.

ESEMPIO 4

Produzione di un Vaccino Ricombinante per il Controllo delle Nascite che Abbia Anche Altre Proprietà Antigeniche Associate alla Stessa Sequenza Nucleotide.

Il gene del βhCG assieme a sequenze che lo abilitino per ancorarlo ad una membrana di cellule infette è una modalità efficace per indurre gli anticorpi contro l’ hCG.

Un’altra modalità che risulta in produzione di anticorpi βhCG assieme con la protezione contro l’infezione virale da epatite B è la seguente:

Il gene del βhCG è clonato in allineamento destroide e in frame con il gene che codifica la proteina di superficie dell’epatite B, che include la porzione codificata della regione S della proteina come anche la regione pre S2. Il modo con cui questa costruzione viene preparata è esemplificato di seguito.

Clonazione dell’ BhCG-HBsAq nei Vaccini.

Il  vettore pSSI (vedi sopra FIG. 1), contenente il βhCG cDNA in un vettore dei vaccini, è stato digerito tramite l’endonucleasi della restrizione, Sma I, che opera un taglio controcorrente della parte terminale del codone(31) dell’ hCG.

Il frammento Hind IH che codifica l’intera proteina mediana della proteina di superficie dell’epatite B (pre S +S region) è stata digerita ed espulsa dal vettore intermedio pJS5 (descritto più sotto), Riempito alla Menow e legato al Sma I si taglia il pSSI per dare origine al plasmide pSS4. (FIG. 5). L’orientazione del gene della proteina di superficie dell’epatite B  relazionato al βhCG è stata verificata da varie digestioni di enzimi restrittivi e tramite Southern blotting (FIG. 6). Questo plasmide è stato usato per creare dei virus vaccinali ricombinanti e i ricombinanti (vSS4) sono stati poi isolati come descritto prima.

Clonazione del vettore intermedio pIS5 :

La mappa genetica dell’Epatites B è stata interrotta dal plasmide pCF80 con la digestione dell’EcoRI. Il  frammento di 3.2 kb di EcoRI (30) è stato purificato in gel di agarosa e poi ulteriormente digerito con lo Nco I per dar vita ad un frammento di circa 1.9 kb (che codifica le proteine X e C) e un frammento di circa 1.3 kb, (che codifica una pre proteina S2+S dell’epatite B), linkers di 10 mer Hind HI sono stati legati al frammento da 1.3 kb e clonati nel sito dell’Hind HI del plasmide pUC 18 per dar vita ai plasmidi pJS5 & pIS6. Il frammento da 1.3 kb EcoRI-NcoI è stato smussato e clonato nel sito Sma I del plasmide pUC 19 per dar vita ai plasmidi pJS7 e pJS8 (FIG. 7).

Saggio del βhCG HBsAq:

Questo virus ricombinante (vSS4) esprime entrambi i βhCG quando viene individuato in un dosaggio radioimmunologico, così come l’antigene di superficie (HBsAg) come misurato dal test Elisa basato sull’anticorpo monoclonale(32) di Abbott (FIG. 8).

L’immunogenicità (33) of Beta hCG-HBsAg

Elementi basilari nei Vac­cini:

I ratti immunizzati con gli elementi descritti sopra attraverso l’inoculazione ipodermica di anticorpi sviluppati ciclicamente contro l’hCG (FIG. 9). Dato per scontato che gli anticorpi contro l’ hCG si sono dimostrati protettivi contro la gravidanza, questa versione del vaccino è anche utile per il controllo della fertilità nelle donne. Inoltre dato il fatto che il gene della proteina di superficie dell’epatite B è anche presente nell’organismo ricombinante ciò significa che il vaccino ha un beneficio immunoprofilattico in un contesto contro l’epatite.

I nuovi vaccini vivi e ricombinanti descritti qui sono stati ben tollerati, nessun effetto collaterale si è osservato durante gli studi ordinari tossicologici intensi e semi intensi nelle due specie animali prese in esame ad oggi.

6

Questi vaccini possono essere impiegati con dei diluenti farmaceutici convenzionali.

RIFERIMENTI NON IN DETTAGLIO NELLA PARTE DESCRITTIVA DEL BREVETTO.

5 S. Chakrabarti, Srinivasan. J, L. Lall, L. V. Rao e G. P. Taiwan “Expression of biologically active human chorionic gonadotropin and its subunits by recombinant vaccinia virus. Gene, 77(1989) 87-93.

10 Chakrabarti S, Brechling K e Moss B.: “Vaccinia virus expression vector: Co-expression of B-galactosidase pro­vides visual screening of recombinant virai plagues. Mol. Cell. Biol., 5,” (1985) 3403-3409.

15 Jain S. K, Chin W. W and Taiwan G. R: “Isolation and  characterization of cDNA clones for and B subunits of ovine luteinizing hormone. J. Biosci., 12(1987) 349-357.

20 Lavanya Lall, J. Srinivasan, L. V. Rao, S. K. Jain, G. P. Talwar e S. Chakrabarti.: “Recombinant vaccinia virus expresses immunoreactive alpha subunit of Ovine Lutein- izing Hormone which associates with B-hCG to generate bioactive dimer”. Indian J. Biochimica e Biofisica, (1988) 510-514.

25 Talwar G. P, Om Singh e Rao L. V: “An improved immunogen for anti-hCG vaccine eliciting antibodies reac-tive with conformation native to the hormone without cross- reaction with hFSH and hTSH” J. Repro. Immu., 13, (1988) 53-63.

30 Om Singh, N. C. Sharma, L. V, Rao, A. Alam A. Gaur e G. P. Talwar (1989): “Antibody response and characteristics of antibodies in women immunized with three contraceptive  vaccines inducing antibodies against human chorionic gona­dotropin” Fertilità e Sterilità: voi. 52, No. 5, 739-744.

Acclamiamo:

           1.   Una sequenza nucleotide (I) che codifica un peptide fuso che consiste in:

35(A) una sub unità β di una gonadotropina mammifera in allineamento in frame di lettura con e seguita da (B) la trans membrana e i domini citoplasmici del gene che codifica la Glicoproteina VSV

40 di cui quando il nucleotide è inserito nel virus.

 


note:

(29) steroidogènei s. f. [comp. di steroide e -genesi]. – In biochimica, la biosintesi degli steroidi negli organismi viventi.

(30) una sequenza specifica di 3 nucleotidi (tripletta) lungo l'mRNA.

(31) Un enzima.

nel virus e il virus viene usato per infettare una cellula ospite, il peptide fuso si manifesta e si ancora alla membrana della cellula ospite.

45

2. Una sequenza nucleotide (I) secondo il richiamo A che include ancora una sequenza nucleotide (H) che codifica una sub unità α di ormone luteinizzante ovino inserito in un virus, indi la sub unità è capace di legarsi al peptide fuso in co espressione con il peptide fuso nella stessa cellula ospite.

3.  Un virus vaccinale che consiste in una sequenza nucleotide secondo il richiamo 1 inserita in una regione  genetica del virus del vaccino non essenziale per la sopravvivenza del virus del vaccino in una cellula ospite.

4.Un virus di vaccino ricombinante che consiste in una sequenza  nucleotide secondo il punto 2 inserita in una regione della mappa genetica del virus del vaccino non essenziale per la sopravvivenza del virus del vaccino in una cellula ospite.

5. Un vaccino per il controllo delle nascite che comprende almeno un virus ricombinante secondo il richiamo 3.

6 Un vaccino per il controllo delle nascite che comprende almeno un virus ricombinante secondo il richiamo 4.

60

7. Un metodo per controllare la fertilità in un mammifero che comprende l’amministrare una certa quantità di vaccino per il controllo delle nascite, secondo il richiamo 5.

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8. Un metodo per controllare la fertilità in un mammifero che comprende l’amministrare una certa quantità di vaccino per il controllo delle nascite, secondo il richiamo 6.


(Immagine in intestazione tratta in http://naturopatia.over-blog.it/pages/La_vaccinazione_di_massa_e_una_ricetta_per_il_disastro-1987552.html   ).


Approfondimenti

 

"IL CLUB DI ROMA E LA POLITICA DI SPOPOLAMENTO DI HAIG-KISSINGER"

http://cieliparalleli.com/documenti013/LB_Club_of_Rome_by_MWC.html




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